（二）布氏菌属的种、型鉴定方法

说明：硫堇、碱性复红浓度分别为20μg/ ml的结果

1、初代分离培养时对CO₂的需要：

分离培养牛种布氏菌的某些生物型和绵羊附睾种，要求在含有5-10% CO₂ 条件下才能生长，在有这两种菌存在的可能时，应作双份培养，一份放普通温箱培养，一份放5-10% CO₂培养箱培养。

2、硫化氢产生试验：

将普通滤纸剪成长7-8cm宽0.8-1cm小条，高压灭菌后泡在10%醋酸铅水溶液过夜，取出放灭菌?排讨校梦孪浜娓桑４姹赣谩＝ǖ?48小时布氏菌斜面培养物用灭菌生理盐水比浊成10亿/毫升的菌悬液，用接种环接种在PH6.6-6.8布氏琼脂斜面上，把醋酸铅滤纸条驾驭斜面与试管壁之间，使滤纸条和斜面保持平衡，不要接触斜面，滤纸条另一端留在试管外1-2cm，置37℃温箱培养，经2、4、6天各观察一次结果，分别以毫米记录滤纸条下端变黑的长度，每次观察完均需要换一次醋酸铅滤纸条，三次变黑长?茸芎臀詈蠼????槐浜谖?跣浴?

3、染料抑菌试验：

先将硫堇（Thionin）、碱性复红(Basic fuchsin)各配成1：1000的染料基础液（用分析?炱骄烦迫×蜉馈⒓钚愿春旄?0.1克，分别放入玛瑙研钵中研磨，边研磨边?渭??匏掖迹?20ml，然后缓缓加入蒸馏?疽撼浞秩芙夂笪阶厣恐校钪张涑?100ml染液，置80℃水浴加热处理一小时，置4??冰箱可长期使用），将100ml定量分装的布氏琼脂溶化后待冷到40-50℃时，无菌操作加入0.1%硫堇或碱性复红2ml或4ml（浓度分别为20μg/ ml、40μg/ ml），摇匀，倒成平板，将平板置37℃温箱过夜，无杂菌生长即可使用。用蜡笔将染料?桨灞趁婊?4-6格，每格标一菌号，将一环10亿/毫升的菌悬液接种于相应的位置，置37℃温箱培养，经2、4、6天各观察一次结果，沿划线（接种菌液?┐τ芯蚓渖の粜浴?

4、单向特异性血清A、M、R凝集试验：

用?式删黄桨寤?10-12小格，小格分别滴上A、M、R血清一滴，用生理盐水将培养24-48小时的布?暇谐删??海媒又只啡【悍直鸺拥?A、M、R血清中混匀，1-2?种映鱿帜粜浴?

注意事项：做血清凝集试验的菌落一定要用24-48小时的布氏菌培养物，血清和菌?旱谋壤惨手校裨蛉菀壮鱿址翘匾煨阅?结果带来困难??

5、噬菌体裂解试验：

(1)单?惴ǎ涸诓际锨碇桨迳嫌美时昙鞘笛榫昝疲炙母鲂「瘢疵?Tb、Wb、BK₂、Fi，将实验菌用布氏肉汤培养24-48小时，比浊成10亿/毫升，用毛细管吸取适量菌悬液，均匀涂布整个布?掀桨澹ザ嘤嗟木海桨甯珊螅梦⒘考?样器分别加??10-15ul Tb、Wb、BK₂、Fi 四种噬菌体RTD液到相应标记好的小格内?珊笾?37℃温箱培养，24小时和48小时各观察一次结果，出现透明的噬菌斑为裂解（+），无噬菌斑为不裂解（?）。

(2)双层法：在布氏琼脂?桨迳嫌美时昙鞘笛榫昝疲炙母鲂「瘢疵?Tb、Wb、BK₂、Fi，将实验菌用布氏肉汤培养24-48小时，比浊成10亿/毫升；同时将5ml0.7%的半固体煮沸溶解，置50℃水浴平衡30min,用吸管吸取0.3 ml的菌悬液，??5ml0.7%的半固体充分混匀，然后倾注到布氏平板，摇匀，待平板干后，用微量加样器分?鸺尤?10-15ul Tb、Wb、BK₂、Fi 四种噬菌体RTD液到相应?昙呛玫男「衲冢??珊笾?37℃温箱培养，24小时和48小时各观察一次结果，出现透明的噬菌斑为裂解（+），无噬菌斑为不裂解（?）。

注意事项：通过实验比较：发现双层法结果易于观察，是切?悼尚械陌旆???

四、布鲁氏菌病特异性血清学检测

A、虎红平板凝集试验（RBPT）
器材及试剂：虎红卡片或清洁玻片、微量加样器或0.1ml毛细管、牙?┗蛳柑俊⒒⒑炜乖⒀粜匝濉⒋煅?.
操作方法：在卡片或玻片上待检血清30μl ,然后加入等量的虎红抗原，用牙签混匀，5min内判定结果，同时做阳、阴性对照.

结果判定：判定凝集程度（-～++++）.

++++：出现大的凝集片或小的粒状物，液体完全透明，100%凝集
+++：有明显的凝集片，液体几乎完全透明，75%凝集
++：有可见的凝集片，液体不甚透明??50%凝集
+：?禾寤熳牵?挥猩倭苛Ｗ次铮?25%凝集
?：液体均匀浑浊.

B、平板凝集试验（PAT）

C、试管凝集试验（SAT）
器材及试剂??试管凝集抗原、待检血清、生理????⑽?堋⑿∈怨堋⑹怨芗堋⑽孪?
操作方法：
1、试管凝集抗原的稀释：用生理盐水将抗原作10倍稀释.
2、待检血清的稀释：每份待检血清用5-6支?∈怨埽∈怨芘懦梢慌牛谝还芗尤肷硌嗡?2.3ml,其余各管加生理????0.5ml，吸0.2ml待检血清加入第一管，混匀后吸0.5ml到第二?埽煸群蟠拥诙芪?0.5ml到第三管，如此类推，作倍比稀释，最后一管弃去0.5ml，???煅?逑∈臀?1：12.5、1：25、1：50、1：100及1：200… 等，第一管弃去1.5ml，留0.5ml实验用.

3、将10倍稀释的抗原0.5ml分别加入各血清管中，最后血清稀释度为1：25、1：50、1：100 、1：200及1：400 …等，摇匀，同时做阴、阳性对照置.

4、比浊管的配制：吸2.0ml10倍稀释的抗原再用生理盐水作1：1稀释，按下表配制比浊管.

5、将试验管、对照管及比浊管充分振荡后置37℃温箱培养24小时，取出后放室温2小?保缓笠员茸枪芪曜寂卸ń峁?

6、结果判定：根据各管中上层液体的清亮度记录结果，特别是50%清亮度（++）对判定结果关系较大.++++：完全凝集，上层液100%清亮.+++：几乎完全凝集，上层液75%清??.++ ：显著凝集，上层液50%清亮.+ ：微?磕喜阋?25%清亮.-：无凝集，液体不清亮.待检血清效价≥1：100++为阳性， 1：50++为可疑，以下为阴性.

D、抗人免疫球蛋白试验（Comb's）

E、补体结合?匝椋?CFT）

?濉⒉悸呈暇肿由镅Ъ觳饧际?

布病的病原体是布鲁氏菌，传统分类鉴定?椒ㄊ歉菖嘌锾匦浴⒀趸缓涂乖卣鳌⑹删辶呀馓氐阋约??饕拗鞯炔煌悸呈????舴治?6个种(species)19个生物型(biovar)：牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)、羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪种布鲁氏??(Brucella suis)、沙林鼠种布鲁氏菌(Brucella neotomae)、绵羊附睾种布鲁氏菌(Brucella ovis)和犬种布鲁氏菌(Brucella canis)，其中牛种布鲁氏菌包括八个生物型，即1??2、3、4、5、6、7、9；羊种布鲁氏菌有三个生物型，??1、2、3；猪种布鲁氏菌有1、2、3、4、5五个生物型，后三种各有一个生物型。传统分类方法是国际公认的?浣峁丫っ鞫粤餍胁⊙Ш筒疾〉姆乐问呛苡幸庖宓摹５嵌越┠攴掷氲降姆堑湫途昙ǚ掷嗍保鱿至艘恍┟堋?

所谓非典型菌株是指用传统常规鉴定布鲁氏菌分型方法不能定种定型的菌株。由于畜牧业地区的人、畜间大面积地进行布鲁氏菌弱毒活菌苗的免疫，大量消毒剂的应用和临床上广泛应用抗生素等的影响，近十年来国内外分离到的非典型布鲁氏菌株以及变异菌株越来越多，它们?笤颊挤掷刖?甑?10~30%。?捎谡庑┚暧τ么车姆掷嗉ǚ椒ú荒茉诜掷啾砩险业胶鲜实奈恢茫唤霰砻髟谙钟胁悸呈暇掷嗉ǖ睦砺凵嫌幸欢ㄈ毕荩匾氖茄现赜跋於圆悸呈暇∫咔?分类的判定，从而不能对此采取合理有效的预防控制措施。因此，对此类菌株的分类鉴定也是迫切需要的??

细菌的分型系统主要有表型分型系统和基因分型系统两类。布鲁氏???撤掷喾椒ㄊ粲诒硇头中拖低场Ｋ孀欧肿由镅У姆⒄梗蚍中偷玫焦惴???研究和应用??渲邪?ㄖ柿Ｍ计追治觥⑷旧?迕盖衅?纬ざ榷嗵?苑治觥?PCR产物的酶切片段长度多态性分析、随机引物PCR、核糖体分型（Ribotype）系统、细菌染色体稀有位点内切酶消化片段的脉冲场凝胶电泳分析（PFGE）等。染色体酶谱虽能较全面地反应不同菌株的差异，但是由于组成条带过多且普通琼脂糖凝胶?缬痉直媪喜睿史治瞿讯却笄抑鞴坌越锨俊Ｓ捎谀壳安悸呈暇挥蟹⑾种柿＃柿Ｃ盖??计追治龇椒ㄒ膊荒苡τ谩?

（一）PCR检测技术：

1、实验材料：

选取布鲁氏菌属的各种型菌株，将冻干菌株在布氏琼脂斜面上复苏后，用三胜黄素做细菌变异试验检查、常规因子血清凝集后，接种布氏?碇?泵???37℃培养48小时后用于DNA提取。

2、主要仪器及试剂??

普通电泳仪、水平电泳槽、PCR仪、凝胶成像仪、高速台式离心机。

PCR反应试剂盒、DNA分子量标准PCR Markers、λDNA/HindIII+EcoRⅠ Markers，琼脂糖凝胶、基因组DNA纯化试剂盒、引物。

注意事项：PCR反应试剂盒Promega公司产品，基因组DNA纯化试剂盒为Promega公司产品或Takara公司产品，PCR反应中的引物由上海生物工程公司合成。

3、实验方法：（DNA提取）

（A）试?梁刑崛〈炕旧?DNA(按试剂盒所附说明操作)

1）将1ml NS比浊菌悬液于1.5ml离心管中；14,000rpm, 2min，移去上清；

2）加入600ul核裂解液Nuclei Lysis Solution，轻轻摇晃至细胞全部再悬起；80℃水浴5min，裂解细胞；然后冷却至室温；

3）加入3ul RNAse 溶液，翻转2-5次,混匀，37℃水浴30min, 冷却?潦椅拢?

4??加入200ul蛋白沉淀液，旋??20sec混匀,冰浴5min；

5??14,000rpm离心，3min；转移上清液至另一1.5ml离心管；

6）加入室温?毂?600ul，轻轻翻转混匀至看到丝状物质出现；14,000rpm离心，3min；小心倒去上清液，在干净的吸纸上吸干离心管。

7）?尤胧椅碌?70%乙醇600ul，轻轻翻转数次洗DNA沉?砦铮?14,000rpm离心，3min，小心?∫掖迹辉诟删坏奈缴衔??胄墓埽椅孪赂稍?10-15min；

8）加入100ul DNA再水化液，4℃过夜；DNA置于2-8℃保存备用。

（B）用煮沸法提取DNA：取1.5 ml离心管?嗪牛?200ul的三蒸水，用接种环挑取在布氏琼脂斜面上37℃培养24-48小时后的纯培养物一环，放在三蒸水中磨开，制成10⁹CFU/ml菌悬液，震荡均匀，置100℃金属浴中煮沸15 min，取出后置-20℃速冻10 min??〕龃?芙夂?10000rpm离心5min，吸取上清液，置2-8℃保存备用。

4、PCR扩增：

（1）BCSP31-PCR：

原理：BCSP31是布鲁氏菌中表达一种免疫原性膜蛋白，存在于布鲁氏菌的6个种各生物型菌株中，根据BCSP31(223bp)蛋白的基因设计的一对引物B4-B5进行PCR，从布鲁氏菌的各种型代表菌株、疫苗菌株和不同现场分离的野毒株都可有清晰的?匾煨岳┰霾铩?

根据编码牛?植悸呈暇恢置庖咴阅さ鞍譈CPS31基因序列，设计引物扩增部分片段，产物223bp。

Primer1：B4 5’-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3’
Primer2：B5 5’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’

扩增反应体系中依??加入的成分、体???团ǘ?：

 BCSP31-PCR反应体系组成

混匀，短暂离心。

扩增参数：预变性                                 93℃         5min;

                   后续循环（30个循环）   90℃                 1min        变性

                                 60℃         1min        退火

72℃         1min        延伸

末轮循环                            72℃         10min       延伸

（2）基因外重复回文序列PCR（Rep-PCR）

Rep-PCR是1996年建立的一种细?蜃橹肝品治龇椒ǎ聪妇蜃橹馗葱蛄?PCR技术，是扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列间的片段，通过?缬咎醮冉戏治觯沂净蜃榧涞牟钜臁Ｏ妇蜃橹?广泛分布的短重复序列??repetitive sequence），包括常用的REP（Repetitive Extragenic Palindromic，基因外重复回文序列）、ERIC（Enterobacteriol Repetitive Intergenic Consensus，肠杆菌基因间重复序列）等，它们在菌株、种、属水平上分布有差异，进化过程又相对??守。在细菌基因???秃脱切图?DNA多态性分析方面有很大的潜?Α? Rep-PCR目前发展迅速并被广泛应用于多种细菌基因分类，此方法操作方便，可以大样本进行。Rep-PCR分辨效果好，可重复性强。可建立各种细菌REP-PCR、ERIC-PCR分型标准数据库。
根据38bp的REP片段设计引物：

Primer3：REP 1R-Ⅰ 5’-III ICG ICG ICA TCI GGC-3’

Primer4：REP 2-Ⅰ  5’-ICG ICT TAT CIG GCC TAC-3’

扩增反应体系中依次加入的成分、体积和浓度：

   REP-PCR反应体系组成

混匀?淘堇胄摹?

扩增?问涸け湫?                                94℃         5min;

后续循环（4个循环??   94℃                 5min        变性

40℃         5min        退火

72℃         5min        延伸

后续循环（26-30个循环） 94??         1min    变性

55℃         1min        退火

72℃         1min        延伸

末?盅??                               72℃         10min       延伸

（3）ERIC-PCR：

根据ERIC序列中的高度保守的中央反向重复片段设计引物

Primer5：ERIC1R  5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3’

Primer6：ERIC 2   5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’

扩增反应体系中依次加入的成分、体积和浓度：

 ERIC-PCR反应体系组成

混匀，短暂离心。

扩增参数： 预变性                               94℃         5min;

后续循环（4个循环）   94℃                 5min        变性

40℃         5min        退火

72℃         5min        延伸

后续循环（26-30个循环）  94℃        1min    变性

55℃         1min        退火

72℃         1min        延伸

末轮循环                       72??         10min       延伸

注意事项：BCSP31-PCR实验中的模板DNA可用煮沸法提取DNA或用试剂盒提取的纯化DNA ，Rep-PCR 、ERIC-PCR实验中的模板DNA则需用试剂盒提取的纯化DNA。

5、琼脂糖凝胶电泳及结果观察：

PCR反应结束后，取反应混合物8μl，用1.5%（wt/vol）琼脂糖凝胶，5V/cm，电泳缓冲液为0.5×TBE（44.5mMTris碱，44.5mM硼酸，1mM EDTA，pH 8.0），分别以PCR Markers、λDNA/HindIII+EcoRI Markers为DNA分子量标准。电泳后0.001%溴?亦ぃ?EB）染色，观察记录结果。参照文献，以分子??Marker（λDNA/HindIII+EcoRI）为标准，计算各主要条带的分子量。然后统一制成一张包括分子量Marker在内的主要条带的模式图。

6、 结果分析：根据PCR产物电泳条带数和位?玫牟煌?圆悸呈暇?掷唷?

（二）脉冲场凝胶电泳（PFGE）

    原理：长度>40kb的DNA分子不能在恒场强水平凝胶电泳中分离，PFGE是通过交替改变电场方向，使大片段DNA在凝胶中不断重新定向，DNA分子越大，这种重排所需要的时间越长，若DNA分子变??方向的时间小于电泳周期时??DNA分子就可以按其大小分开。PFGE是分离大片段DNA的最有效方法。是细菌?源静〖嗖狻⒋驹纷佟⒋ネ揪兜鞑椤⒑褪侗鸬挠行侄巍?

实验操????

1、胶块?闹票?

（1）取经??鉴定的布氏菌，接种布氏琼脂培基（或血平板）培??48小??(犬种菌24小时) ，挑取适量菌苔置于有2ml细胞悬浊液（CSB）的falcon2054管中，制成菌悬液?茸鞘钩?OD值3.6-4.5（Dade microscan turbidity meter 浊度测定仪为0.48-0.52）；

（2）取400ul菌悬液于1.5ml离心管?拥鞍酌?K（20 mg/ml）20ul,混匀后37℃水浴5-10min, 取400µl?と群玫?1%SeaKem Gold:1%SDS (56 ℃)混合液于细胞悬浊液中,用枪头轻轻混匀，避免气泡的产生，取适量混合液迅速加入模具,在室温放置10-15min。

注意事项：除非有特别说明，否则整个实?楣??趟??玫乃???ㄊ约良叮┐克??平嚎槭保??碇?俏⒉??尤热芙猓?56?嫠『阄拢赴肭碇堑忍寤煸龋尤肽＞撸?可??4℃*15分钟冷却。剩余细胞悬浊液要置于冰上，直到胶块完全制备好才可以丢掉。

2、胶块内细胞的裂解

（1）取出胶块，将胶块放在50ml的screw-cap tube中，每管加入细胞裂解液（CLB）/蛋白酶K混合液5ml；

（2）??54℃水浴摇床中孵育2小时，同时将纯水和TE放在50℃水浴箱中预热。

注意事项：蛋白酶K使用时再加入CLB中，终浓度0.1mg/ml。确保胶?樵谝好嫦拢乐拐吃诠鼙诨蚋亲由稀?

3、洗胶块

（1）倒出screw-cap tube中的CLB, 每管加预热的纯水15ml, 在50℃水浴摇床中洗2次, 每次10min。

（2）倒出水,每管加15ml预热的TE，在50℃水浴摇?仓邢?4次,每次10-15min。 

注意事项：再次加入液体时要确保胶块在液面以下,防止胶块粘在管壁或盖子上。每次倒出液体后管子要倒置在吸水纸上尽可能清除残留液体。

（3?┫春蟮慕嚎榭杉尤?TE 4℃保存备用。

4、胶块中DNA的酶切

（1）在干净的平皿上切下2mm宽的胶块，置1.5ml的EP管中。

（2）加 200ul Xba??酶切缓冲液，??37 ℃孵育10min。

（3）小心吸出缓冲?海?尤朊福?盖谢撼逡?(含XbaⅠ酶50u/胶块) 酶切，37 ℃孵育至少2小时。

注意事项：在平皿上划线，胶块大小保持一致。吸出酶切缓冲液时避免损伤?嚎椋浮⒒撼逡阂糜诒希⒁獍衙福撼逡夯煸龋繁＝嚎樵诿福撼逡阂好嫦拢??饨嚎檎吃诠鼙谏稀?

5、加样

（1）吸出EP管中的酶??撼逡海?

（2）加入200 µl 0.5×TBE平衡5-10min；

（3）调整好梳子的高?龋??故嶙映莺徒翰鄣牡撞肯嘟哟ィ嚎?直接粘在梳子齿上；

（4）制备100ml 1% SeaKem Gold 琼脂糖?海浞只糜?56 ??水浴锅中平衡温度，倾倒制胶；

（5）待胶至少凝固30min后，?⌒??纬鍪嶙印?

注意事项：枪头避免损伤胶块，用吸水纸或棉签吸取胶?橹芪У亩嘤嘁禾澹盟揭堑髡翰凼蛊渌剑?胶块和胶槽的底部相接触，并室温下风??3-5min，但?苊夤伞４咏翰鄣撞恐醒牖郝谷耄苊馄莶耗糖敖勾ザ褐辽倌?30min。

6、电??

（1）    电泳槽中加0.5*TBE液2200ml,在14℃恒温，将胶放入电泳槽，准备电泳；

（2）    200v脉冲参数2-25s 18h或5-18s 18h或10-45s 20h。

注意事项：把胶放入电泳槽前清除胶槽底部和边缘的多余胶。

7、图像获取及结果分析

电泳结束后，用0.5mg/ml EB染色30?种樱?诿鹁??焉??危?看?20分钟，即可读胶，获取结果并进行分析。

（三?┓肿釉咏患际酰ɑ蛱秸耄裕?

投稿人：陈经雕

单位：广东省疾病预防控制中心

（2006-9-5）